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        細胞治療篇 —— 細胞治療產品的生物分析概覽

        2023-12-01    行業資訊

        一、細胞與基因治療產品概述


        細胞與基因治療(Cell and Gene Therapy, CGT)按產品形式可主要分為體外(Ex vivo)基因治療和體內(In vivo)基因治療。


        一般來說,體外基因治療主要涉及基因改造的細胞療法(Cell therapy),指獲取患者的目的細胞后,在體外經過基因修飾技術(如調節、替換、添加或刪除基因等)以改造其生物學特性,再回輸至患者體內用于治療人類疾病的活細胞治療方式。體內基因治療則主要指傳統的或狹義的基因療法(Gene therapy),是將治療產品直接注射至患者體內,在基因水平上干預基因表達、修正的治療方式。


        體外(細胞)基因治療產品在臨床應用中主要涉及免疫細胞基因治療產品、干細胞基因治療產品和其它細胞基因治療產品;而體內基因治療主要包括病毒載體基因治療、脂質載體基因治療和核酸基因治療。不過,體內基因治療產品將不在本推文的論述范疇。


        免疫細胞基因治療是通過采集患者自體或同種異體的免疫細胞,經過體外培養并進行基因修飾和改造,使其具有靶向殺傷能力,再回輸至患者體內,通過直接靶向殺傷目標細胞、調節免疫系統、減弱免疫耐受、激活免疫響應等方式進行干預和治療。


        根據采用不同免疫細胞、基因工程改造特點,免疫細胞基因治療的主要分類為CAR-T、CAR-NK、T細胞受體基因工程改造的T細胞(T cell receptor - engineered T-cell, TCR-T)等方式。不過,對于未經基因改造的細胞療法諸如腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor - infiltrating lymphocytes, TILs)、細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine - induced killer cells, CIK)等不屬于免疫細胞基因治療。


        發展最為成熟的免疫細胞基因治療是針對淋巴瘤的anti-CD19和anti-BCMA CAR-T細胞療法,目前已有多款CAR-T產品獲得中國NMPA、美國FDA、或歐盟EMA等監管局批準上市,還有一款是同種異體T淋巴細胞自殺基因免疫療法的Zalmoxis?(已退市),用于輔助治療造血干細胞移植后的移植物抗宿主病。



        細胞療法圖.png

        干細胞具有自我更新、多向分化潛能、良好組織相容性的特性,可作為基因治療藥物的細胞載體,在再生醫學領域和CGT領域具有廣闊的應用前景。人源干細胞及其衍生細胞的基因治療產品涉及人源自體或同種異體干細胞,經體外操作(包括提取、分離、純化、培養、擴增、基因編輯/基因修飾、誘導分化、凍存及復蘇、運輸等一系列過程)形成臨床試驗的產品制劑,對干細胞的錯誤基因進行編輯和修正后再回輸(植入)至患者體內,可用于遺傳性疾病的干預和治療。

        干細胞基因治療產品不僅具有細胞治療產品的特點還兼具基因治療產品的特性,對臨床試驗設計要求更高,但現階段臨床數據多是單中心、小樣本、罕見疾病,對該類治療產品的開發以及其相關的安全性、有效性帶來諸多挑戰。因此,科學、充分的生物分析能夠保障干細胞基因治療產品在臨床試驗階段順利進行,是不可或缺的重要組成部分。

        干細胞基因治療主要集中在罕見病和神經退行性疾病,在歐美地區獲批上市的干細胞基因治療產品包括用于治療腺苷脫氨酶嚴重聯合免疫缺陷癥的Strimvelis?、治療輸血依賴性β-地中海貧血的Zynteglo?、治療早期腦型腎上腺腦白質營養不良的Skysona?以及治療早發性異染性腦白質營養不良的Libmeldy?。



        二、細胞治療產品的生物分析


        在CGT產品進入體內后,細胞可能分化成預期和非預期的多種細胞類型、互相之間進行轉換,尤其是由多種細胞亞群混合的治療產品,也可能發展至其它作用機制(MOA)的治療功能。另一方面,細胞產品由循環系統遞送全身可能導致細胞分布到各個組織,即使移植至目標組織區域(如骨髓)也可能產生非預期的遷移,因此需要對細胞產品的生物分布、歸巢和追蹤監測進行研究。當CGT產品整合至基因組時可能發生不受控的基因編輯(基因突變),導致關鍵基因的激活或失活,進而誘發癌變的發生。


        CGT產品既有細胞治療產品的特點,也有基因治療產品的潛在風險,臨床試驗的生物分析則是CGT產品研發的重要內容之一,因為充分的臨床生物分析能夠:

        1.闡明CGT產品在人體內的藥代(細胞)動力學特征,為給藥途徑、給藥劑量等選擇提供支持性證據;

        2.確認CGT產品的作用機制,基因修飾的目的、功能,以及轉基因蛋白的表達水平,明確CGT產品的治療效果和治療機理;

        3.根據潛在的生物風險因素,預測人體給藥后的一系列免疫反應特征,確認不良免疫反應(適應性免疫和固有免疫)的臨床監測指標,為制定臨床風險控制措施提供參考依據。


        因此,建議開展充分的生物分析研究,收集用于評估的數據和信息,以確立所開發的CGT產品在生物分析角度具有合理的、可接受的獲益風險比,為臨床試驗設計和風險控制策略提供證據支持。



        三、藥代(細胞)動力學分析


        CGT產品的藥代動力學(細胞動力學)特征與傳統小分子藥物或大分子生物藥有明顯的區別,大多數CGT產品難以通過傳統的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)等分類方式進行藥代動力學評估。


        CGT產品的藥代動力學研究應能闡明細胞產品在體內的生物學過程以及伴隨的生物學行為,根據細胞治療產品類型和特點(尤其是免疫細胞基因治療與干細胞基因治療)、研究目的及檢測指標的臨床價值,建立合理的生物分析方法并對方法進行必要的驗證。


        藥代動力學研究應主要關注目標細胞進入體內后的數量變化、監測細胞活力/表型分化(例如細胞表型和功能標志物)、持續時間(例如血藥濃度-時間曲線下面積、達峰濃度、達峰時間等特征常數)、預期存活期內的功能(或替代標志物)、體內生物分布、異位灶、組織嗜性/遷移、生物分子的表達和/或分泌、以及與宿主組織的相互作用關系等特征;有時,相互作用還可以包括細胞治療產品的非細胞成分以及分泌的生物活性分子引起的相關組織反應。


        CGT產品的藥代動力學檢測通常建議在方法開發階段采用多種檢測方式評估并監測目標細胞在體內的情況,由于免疫細胞基因治療和干細胞基因治療是經過基因工程技術修飾過的產品,可以同時采用熒光定量PCR(qPCR)和流式細胞術(Flow cytometry)進行分析,這兩種技術手段分別測定外源基因拷貝數和目標表型陽性(如CAR+、外源基因+)的細胞數量變化,可以更全面的分析細胞治療產品在體內的擴增和存活情況。


        在設計藥代動力學檢測方法和相互驗證時,可以將PCR法檢測結果理解為產品在機體內的“總數”,而流式細胞術的檢測結果則更偏向于“有效數”(圖2)。廣泛應用的PCR法包括qPCR和數字PCR(dPCR),用于監測體內轉基因的拷貝數。首先根據轉導的外源基因序列設計高度特異性的引物和探針(通常設計的區域可位于scFv、兩段基因的交界處等)、制備基因組DNA標準品、選擇適宜的內參基因(如ACTIN、CDKN1A),以及根據qPCR的反應效率和gDNA量進行因子修正,最終在受試者血液樣品中確定單位gDNA的CAR轉基因拷貝數。為了評估qPCR法在CAR-T細胞中的分析靈敏度和重復性,可應用數字PCR技術對CAR拷貝數進行絕對定量,并將結果作為qPCR檢測方法的參考拷貝數。


        數字PCR技術還能增加罕見事件的檢測機率并減少檢測的變異性,當采樣的時間足夠長會導致目標分析物的豐度變得很低,進而需要靈敏度極高的分析方法時,可考慮開發基于數字PCR的分析方法。對于基于流式細胞術的方法開發和驗證階段首要考慮的是構建適用的標準陽性細胞樣品,理想陽性對照品則是細胞治療產品本身,但實際情況大多難以實現,因此構建陽性細胞標準品的目標則是最大程度接近預期用途樣品。

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        圖2: 藥代動力學(細胞動力學)檢測方法的比較

        Kymriah?(Tisagenlecleucel)是一款抗CD19 自體CAR-T 免疫細胞基因治療,通過識別CD19靶向結合惡性腫瘤細胞,CAR傳遞信號促進CAR-T細胞激活增殖、清除靶細胞和保持持久性。以流式細胞術檢測得到的藥代動力學(細胞動力學)表現為治療早期短暫下降,隨后CAR-T細胞通過與CD19靶點結合得到激活并增殖,在28天內達到峰值并維持較高水平,后面CAR-T細胞群因耗損呈一定的下降趨勢,但能保持長期存在。qPCR分析得到的結果與此類似,但檢測到的信號更為持久。通過qPCR和流式細胞術兩種方法比較CAR-T細胞檢測結果,qPCR檢測靈敏度相較于流式細胞術更高。


        盡管大多數在歐盟EMA獲批上市的干細胞基因治療產品尚未描述其產品的藥代動力學特征,但在早期設計臨床試驗方案時,應盡可能開展針對干細胞基因治療產品的體內過程研究。



        四、藥效學分析


        藥效學研究應采用可靠的檢測方法來驗證細胞治療產品的基本治療機理,臨床試驗設計應考慮細胞治療產品的MOA、疾病周期長度以及給藥方式等因素,結合細胞治療產品自身特性和細胞在機體的存活時間。


        對于大多數免疫細胞基因治療產品,可以通過細胞和/或體液免疫應答分析藥效學活性。當治療產品有一個或多個特異性靶點時,應分析其對每個靶點的作用活性。如果產品具有分泌特定蛋白、多肽或其它活性成分、亦或是敲除基因的,也需要進行針對性藥效學分析,如檢測特定蛋白的活性、持續時間和變化情況等。


        免疫細胞基因治療產品可能在體內存活較長時間,并產生長期療效,確證性試驗的臨床考察點還應關注療效的持續時間。由于臨床試驗的持續時間和受試者數量受限,以及免疫細胞基因治療產品尚缺乏大規模臨床應用經驗,上市后通過收集真實世界數據,有助于進一步考察產品的長期療效。


        美國FDA發布的CAR-T細胞產品開發指導原則《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products》的VI.-C.-2.節建議:藥效學評估指標包括效應細胞因子、免疫分型和腫瘤細胞殺傷的變化水平(MRD)。藥效學方案的設計要能反映標志物的效應特點和預期反應持續時間,且探索性的相關分析涉及CAR-T細胞產品的效應與藥代動力學特征間的關系,并結合CAR-T細胞暴露量與藥物效應進行分析(下圖和表)。

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        表1.jpg

        Yescarta?是一款抗CD19自體CAR-T免疫細胞基因治療產品。分析相關細胞因子(包括CRP、Granzyme B、IFN-γ、TNF-α、IL家族)的表達水平,在峰值和Day 28通過比較高于基線2倍的患者比例來評估CAR-T細胞產品的藥效學。


        干細胞基因治療產品具有自我復制和多向分化潛能,它們在體內的存活和作用持續時間相較于免疫細胞基因治療產品更長,體內藥效學的研究方法成熟度不如傳統藥物成熟、甚至不如免疫細胞基因治療產品。接受干細胞基因治療的受試者可能終身伴隨該類細胞產品,如果細胞產品因非預期地增殖而過表達,將導致基因表達產物的毒性蓄積。應根據外源基因的表達情況和功能活性設計藥效學生物分析策略,可考慮檢測的PD生物分析目標物包括:

        1.外源基因的水平和持續時間;

        2.基因表達產物的暴露量和生物分布;

        3.基因表達產物的功能活性/酶活性水平;

        4.細胞表面標志物的分型和比例。


        應當注意的是,鑒于細胞治療產品種類繁多、各有特點,具體選擇哪類生物分析目標物應當合理地結合干細胞基因治療產品本身特性以及主要研究者的決策,更好地表征細胞治療產品藥物效應動力學的量效關系,充分解釋預期或非預期的臨床試驗結果。

        圖4.png

        圖4 干細胞基因治療產品的藥效學生物分析

        Libmeldy?是一款自體CD34+ HSPC干細胞基因治療,利用慢病毒載體轉導ARSA基因至自體CD34+ HSPCs基因組中,使干細胞能夠表達功能性ARSA,用于治療早發性異染性腦白質營養不良。經Libmeldy?治療后檢測ARSA的功能活性水平(ARSA activity),在給藥后3個月達到正常生理水平,并在整個隨訪期中患者穩定保持或高于正常參考范圍(灰色區域)。注:ARSA(Arylsulfatase A),芳基硫酸酯酶A。


        而其它類型細胞的基因治療產品如果是用于修復/免疫調節/替換細胞/組織,并有望能夠終生發揮功能,除了上述研究內容可考慮納入外,相關的結構/組織學檢測指標也可作為潛在的藥效學標志物進行檢測,包括鏡檢、組織學檢測(IHC、IF)、成像技術(MRI、B超、X射線)或酶活性指標檢測等。



        五、免疫原性分析


        1.體液免疫反應


        對于CGT產品,誘導機體產生免疫反應的主要因素包括:

        (1)轉基因的外源產物蛋白(例如CAR基因表達蛋白、缺陷修正的轉基因表達蛋白等);

        (2)同種異體細胞(通用型CAR-T細胞)。免疫反應主要由固有免疫反應、適應性體液免疫和細胞免疫反應,體液免疫反應由B淋巴細胞驅動產生針對外源CAR蛋白或CAR-T細胞的抗體,即抗藥抗體(ADA)和中和抗體(NAb)。


        外源CAR蛋白是基因工程化的非天然產物,CAR結構中的scFv和胞內胞外蛋白拼接結構是誘導機體產生體液免疫反應的主要因素,部分CAR-T細胞產品的scFv甚至是鼠源序列,其免疫原性風險可能更高。這些由體液免疫反應產生的ADA可能減弱或阻礙細胞產品的生物學功能,進而降低細胞產品的有效性,甚至引發非預期的不良反應、增加治療安全性風險。配體結合測定法(Ligand binding assay, LBA)和基于細胞的檢測方法(Cell Based Assay, CBA)常用于CAR-T細胞的免疫原性測定。


        若CAR-T產品是自體產品,傳統的LBA(如ELISA)可用于評估CAR胞外結構域的ADA,但是,重組表達的游離CAR蛋白是無法完全表征CAR-T細胞在生理狀態下的胞外結構,該方法可能對細胞免疫原性的評估缺乏足夠的敏感性和準確性。


        不過,它的優勢在于方法學開發和驗證過程相對簡單,整體開發時間往往較短,更適合早期的探索性臨床研究。流式細胞術是免疫原性檢測的首選方案,它不僅可以評估ADA的水平、也可以用于評估預存抗體的存在,而且對同種異體(通用型)CAR-T細胞產品,流式細胞術也能夠評估因同種異體發生的體液免疫反應。


        流式細胞術方法開發的難點在于:

        (1)預期用途的標準品細胞數量非常有限,很難建立受試者特異性的檢測方法,因此基于穩轉細胞系(CHO、Jurkat等)或轉導CAR-T的健康供體T細胞可考慮作為標準細胞樣品;

        (2)ADA陽性對照抗體的制備開發與優化驗證也是挑戰之一,需要制備并應用人源的ADA陽性對照抗體,以避免ADA樣本與陽性對照抗體的物種差異;

        (3)CAR-T預存抗體是確定Cut point的干擾因素,應謹慎處理,以避免檢測臨床樣本時發生假陽性誤判。

        表2.png

        Kymriah?(Tisagenlecleucel)對體液免疫原性的評估,使用流式細胞術檢測受試者血清中與Kymriah?結合的anti-MCAR19抗體。人血清樣品中的anti-MCAR19抗體由轉染MCAR19的Jurkat細胞系捕獲,未轉染的Jurkat細胞作為對照品,并檢測細胞所有結合的IgG/M(anti-MCAR19抗體)?;€顯示89.9%(62/69)受試者顯示出預存抗體,在治療后任意時間節點出現檢測結果陽性的患者比例達到94.2%(65/69)。


        2.細胞免疫


        接受CAR-T細胞治療時,CAR-T細胞自身可能誘發細胞免疫應答而產生針對CAR-T細胞的細胞毒性攻擊。CAR-T細胞能夠通過MHC I型分子遞呈外源重組的CAR結構,并被細胞毒性CD8+ T細胞識別,活化的CD8+ T細胞針對CAR-T細胞進行靶向攻擊并裂解,導致CAR-T細胞數量減少,進而導致療效下降。在臨床試驗階段,監測細胞免疫反應是安全性評估的另一項重要生物分析。


        細胞免疫原性也可以通過多種檢測方法進行評估和監測,最常用、最成熟的方法之一是ELISpot(Enzyme-linked ImmunoSpot Assay)。完整的CAR-T氨基酸序列用于構建重疊短肽的肽庫,這些多肽將被添加至受試者PBMCs中,如果受試者的PBMCs樣品存在能夠識別某個多肽段并產生反應性的T細胞,這些T細胞將分泌一系列的炎癥細胞因子,如IFN-γ,將在ELISpot上讀出一個單細胞陽性斑點。ELISpot也可以作為細胞毒性試驗的檢測方法,用于評估針對CAR靶細胞的細胞毒性裂解能力。此外,流式細胞術也能夠用于檢測細胞免疫原性,使用CAR-T衍生的系列多肽刺激PBMCs,通過胞內炎癥細胞因子染色技術評估產生的細胞因子水平。


        盡管CAR-T細胞療法已在臨床經過驗證,但我們并不完全了解免疫原性對免疫細胞基因治療產品所帶來的潛在影響,全面地評估免疫原性并構建合理的生物分析檢測方法是至關重要的,這些臨床檢測數據將在免疫細胞基因治療的整體療效和安全性評估上發揮關鍵作用。



        六、生物標志物分析


        CGT產品的生物標志物可以包括:診斷性、預測性、預后性、監測性、安全性等生物標志物。


        早期探索性臨床試驗可以通過二代測序(NGS)的方法評估受試者基線組織的基因表達與突變特征、利用生化分析儀檢測基線的血清生物標志物、或者設計檢測靶點表達情況以表征診斷性生物標志物。不過,生物標志物并沒有絕對的界限與分類,主要研究者可依據CGT產品的特性和生物分析經驗,自主設計探索性研究內容。


        免疫細胞基因治療主要的不良反應涉及細胞因子釋放綜合征(CRS)和神經毒性(ICANS),受試者體內細胞因子可能由治療驟然升高,而嚴重的神經毒性可能導致受試者認知障礙。


        對這些不良反應的早期干預調控、全程監測、后續長期隨訪十分重要,甚至能夠影響免疫細胞基因治療的效果。申辦方應對受試者的基線和預定的時間節點監測這些細胞因子的水平,以便實時掌握細胞因子釋放的動態變化情況。


        在臨床試驗開展前提供檢測細胞因子的生物分析方法,這需要定制化設計并檢測多種細胞因子,包括炎癥相關因子、生長因子等,以便更好地闡明細胞產品的作用機制和藥效關系。在制定所需檢測的生物標志物panel時,可參考同類上市或臨床階段競品的設計方案、已披露的臨床試驗結果,結合自身產品的特性和本次臨床試驗需要考察的目的和意義,合理地制定生物標志物分析對象。


        尤其,細胞因子的檢測是高度可變的,隨著臨床試驗I/II/III期的推進以及各生物分析數據的積累,主要研究者需要靈活地、準確地判斷和優化生物標志物檢測方案,尤其早期臨床試驗的生物標志物檢測結果可能直接作為后續研究方向的重要依據。其多因子分析的難點在于各類細胞因子的動態范圍差異較大,需要的生物分析方法要具備足夠的分析靈敏度以及足夠寬的檢測動態范圍,才能保證在檢測和分析時能夠涵蓋目標分析物。常用的細胞因子生物分析平臺如ELISA、MSD、Luminex、Simoa,在檢測細胞因子上有各自的優缺點,應謹慎選擇。


        注:醫學專業名詞對照表(Glossary)

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        文章來源: Biologics CMC


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